cultivos celulares
cultivo celular
conjunto de tecnicas que permiten el mantenimiento, la multiplicacion, la supervivencia y la diferenciacion celular de las celulas in vito en condiciones controladas.
Las celulas cultivadas mantendran al maximo posible sus propiedades fisiologicas, geneticas y bioquimicas.
ventajas y deventajas de la propagacion de celulas fuera del organismo de origen
ventajas:
son faciles de manipular en condiciones controladas,
permiten la conservacion durante largos periodos de tiempo con apenas perdida de viabilidad,
disminuye la necesidad de realizas ensayos in vitro y se considera una alternativa al uso de alnimales,
mayor homogeneidad de la muestra ya que se mantiene en cultivos de linaje celular definido.
Inconvenientes:
se debe trabajar en estri tas condiciones de asepsia ya que los principales contaminantes ( moho, bacterias y levadura) crecen mas rapido que las celulas animales.
contaminacion biológicas en cultivos
contaminacion originada por bacterias, hongos, virus, micoplasmas y contaminacion cruzada por otras celulas eucariotas cultivadas en el laboratorio.
la contaminacion bacteriana y fungica se ve a simple vista.
la contaminacion por micoplasmas y virus es invisible.
cultivos de:
organos, explantes primarios, celulas disociadas y culticos organotipicos e historipicos
cultivo de organos
consiste en el mantenimiento de un organo o parte de el para preservar, aunque sea parcialmente, su estructura y funciones.
se coloca el organo o porcion sobre una rejilla situada en la interfase liquido gas de un medio de cultivo del que extrae nutrientes y elimina desechos metabolicos
ventajas e inconvenientes del cultivo de organos
ventajas:
se mantiene la organizacion tridimensionas y la mayor parte de las caracteristicas histologicas,
permite mantener los diferentes tipos celulares diferenciados constituyendo una buena replica del organo.
inconvenientes:
la proliferacion velular es limitada porque el crecimiento celular solo se produce en la periferia,
se necesita nuevo material para cada experimento debido a la falta de propagacion,
la cantidad de material que cultivar es reducida y su cuantificacion es complicada.
cultivo de explantes primarios
consiste en colocar un fragmento de tejido en la interfase solido liquido de un soporte de vidrio o plastico y nutrirlo con un medio adecuado.
los fragmentos de tejido se adhieren a la superficie solida en la que las celulas de la periferia del explante pueden migrar y proliferar. es util en pequeñas cantidades de tejido como una biopsia de piel o vellosidades carionicas.
cultivo de celulas disociadas
es el mas utilizado debido a su capacidad de propagacion. es el crecimiento in vitro de celulas individuales no organizadas en tejidos. se pueden optener a partir de explantes primarios, de lineas celulares o de suspensiones de celulas disgregadas por medio de sistemas mecanicos, enzimaticos o quimicos.
en este tipo de cultivo se pierden las interacciones celula-celula o celula-matriz extracelular. pero siguen siendo capaces de proliferar notablemente.
se dice que un cultivo a alcanzado la confluencia cuando las celulas ocupan toda la superficie disponible y detienen su proliferacio. y crecimiento. por este motivo es necesario cada cuerto tiempo realizar un subcultivo o pase.
subcultivo o pase
es el transplante de celulas de un envase de cultivo a otro u otros. el numero de pases es el numero de veces que las celulas se han subcultivado.
senescencia
las cdlulas tienen una vida que puede prolongarse entre 20 y 100 generaciones dependiendo de la celula. a partir de este momento la celula pierde la capacidad de proliferacion y mueren.
celulas tumorales
estas son capaces de evitar la senescencia y seguir proliferando o crecer de forma indefinida, a lo que se le llama linea celular continua, en investigacion se utilizan estas celulas que se han adaptado de manera espontanea o inducida para crecer continuamente.
cultivos segun el estado en el que se encuentren las celulas
cultivos en monocapa:
contiene celulas adheridas a un soporte solido de plastico o vidrio,
la adhesion al sustrato es requisito para la proliferacion celular porque las celulas son anclaje dependientes,
es el metodo mas usado para todas las celulas excepto las hematopoyeticas,
las celulas del cultivo se disgregan por metodos enzimaticos y se pasa a un frasco de cultivo.
cultivos en suspensión :
crecen sin la necesidad de adherirse a un sustrato porque son independientes del anclaje,
las celulas estan dispersas en el medio de cultivo,
solo proliferan las celulas hematopoyetucas, madre, lineas celulares transformadas y las celulas tumorales,
se obtienen por dilucion y se pasan a un medio fresco.
cultivos segun su forma de mantenimiento de ph del medio
cultivo cerrado:
se encuentra en un frasco cerrado por lo que el ph cambiara y para regular eso se in orpor al medio un HEPES, es un buffer que amortigua los cambios de ph, asi no sera necesario un incubador con sistema de regulacion de gas y humidificacion.
cultivo abierto:
el frasco de cultivo se mantiene medio abierto en el incubador que le proporciona una atmosfera de 95% de aire y 5% de CO2.
cultivos segun la procedencia dd la suspension celular de partida
cultivo primario:
procede directamente de un tejido sin haber pasado previamente por un crecimiento in vitro, directo del organismo vivo.
cultivo secundario:
se obtiene a partir de un cultivo primario, de otro secundario o de una linea celular mantenida en congelacion.
cultivos histotipicos y organotipicos
cultivos que tienen como finalkdad crear tejidos in vitro completamente funcionales para utilizarse en injertos o transplantes.
cultivo histotipico:
las celulas crean una estructura tridimensional similar al tejido original, tienen un unico tipo celular y son cultivos de alta densidad.
cultivo organotipico:
tienen varios tipos de celulas muy parecidas al tejido original.
que se necesita para hacer un cultivo
medio de cultivo: proporcionan nutrientes y soporte para las celulas.
sustrato: para q las celulas tengan una superficie a la que adherirse.
incubacion: en condiciones controladas de temperatura, humedad y gases.
tecnica aseptica: para evitar la contaminacion por microorganismos.
componentes medio de cultivo
aminoacidos: estimulan la viabilidad y el crecimiento celular.
vitaminas: facilitan el crecimiento y la proliferacion celular.
hidratos de carbono: principal fuente de energia, glucosa,galactosa maltosa y sacarosa.
sales minerales: son las responsables de la osmolaridad del medio que debe ser isotonica o ligeramente hipotonica respecto a las celulas cultivadas.
tampon: los sistemas tampon regulan el ph del medio ya que las celulas son muy sensibles al cambio, se usa el HEPES.
indicador de ph: las. celulas crecen en un rango de 7'2/7'6, 7'4 y para detectar cualquier cambio los medios llevan un indicador de ph.
antibioticos: para prevenir la contaminación por bacterias, penicilina y estrptomicina.
antifungicos: para prevenir la contaminación por hongos, anfotericina.
suero: liquido rico en nutrientes, proporciona al medio hormonasy factores de crecimiento que mejoran la supervivencia, proliferación y diferenciacion celular, mas imp FBS suero fetal bovino.
medio de cultivo mas usado
RPMI
recipientes y sustratos
frascos Roux, placa de Petri, placa multipocillo,tubos 10-15ml
frascos Roux
pueden ser de diferentes tamaños y se utilizan para cultivos en monocapa. tienen un tapon regulable con filtro que permite el intercambio de gases y que noentren microorganismos
placa de Petri
proporciona solo un compartimento para cultivo y es el soporte utilizado para el cultivo de tejidos
placa multipocillo
dispone de varios compartimentos de cultivo y se utiliza fundamentalmente para pruebas de diferentes tratamientos en las mismas condiciones, como un ensayo farmacologico o de toxicidad.
tubos de 10-15ml
se utilizan para cultivos en suspension. los cultivos de sangre o medula osea para cariotipo deben contener heparina de litio como anticoagulante.
sustratos
revestimientos que llevan los soportes utilizados para cultivo celular y que permite la adhesion de las celulas y favorecen la proliferacion y diferenciacion celular
microscopio invertido
el grosos de los soportes fisicos en los que se lleva a caboel cultivo celular imposibilita la observacion bajo el microscopio optico debido a la pequeña distancia entre platina y objetivo
condiciones de incubacion
temperatura: la temperatura optima de crecimiento de las celulas depende de la temperatura corporal del organismo donde se han obtenido las celulas, el ser humano 37. las celulas son muy sensibles a los cambios de temperatura, si llega a 40 se mueren.
humedad: es importante mantener la humedad adecuada para evitar el secado de cultivos, que producira un aumento de la C de algunos componentes,variaciones de ph y tonicidad. algunos incubadores disponen de un generador de vapor o atomizador para controlar la humedad, los mas antiguos usan agua para q se evapore.
atmosfera gaseosa: el CO2 y O2 son componentes muy importates. un aumento de oxigeno puede ser toxico debido a la formacion de radicales libres y el CO2 es muy importante porque se disuelve en el medio y establece un eq con los iones de bicarbonato y estabiliza el ph. la C de CO2 de de 5%, entre 2% y 8%.
inicio de cultivo
una vez que se obtiene la suspension celular homogena por disgregacion, seleccion o descongelacion se siembran las celulas.
1- verter una cantidad de suspensio celular durectamente sobre el sustrato del recipiente y añadir el medio de cultivo
2- añadir la suspension celular la recipiente que ya tiene el medio de cultivo.
3- verter la muestra de suspension celular directamente sobre el sustrato del repitiente y añadir el. eduo de cultivo 30 min despues, favorece a la adhesion.
contaminacion
si ocurre una contaminacion hay que eliminar rapidamente los cultivos y reactivos contaminadospara evitar su propagacion. y hay que revisar si la tecnica esteril es corre ta y analizar el origen de la contaminacion.
linea celular o cultivo secundario
cuando el cultivo primario es subcultivado
pase de celulas de cultivos en monocapa
1. retirar todo el medio de cultivo.
2. lavar con 5 ml de solucion de PBS ( tampon fosfato salino) y retirar.
3. añadir solucion de tripsina.
4. llevarlo al incubador golpeteando esporadicamente el recipiente para facilitar que las celulas de despeguen.
5. comprobar con el microscopio invertido que las celulas se han tripsinizado.
6. neutralizar las celulas con un medio de cu,tivo fresco.
7. tomar el volumen correspondiente de la suspension celular y agregar a una placa nueva.
8. añadir un medio de cultivo fresco con volumen final de 5-10ml.
por que se realiza un cambio del medio de cultivo
el crecimiento adecuado de las lineas celulares provoca un empobrecimiento del medio al consumirse los nutrientes y acumularse desechos.
cambio del medio de cultivo
1. retirar casi todo el medio de cultivo de las celulas (2/3).
2. incorporar un medio de cultivo nuevo.
3. reanudad la incubacion en coniciones adecuadas.
indicador de ph del cultivo
rojo fenol.
crioconservacion
tecnica que consiste en congelar celulas o tejidos para reducir o cazi anular su metabolismo celular y almacenarlas de forma indefinida. suele utilizarse a una temperatura de -80°C ultra ongelavion, -190°C N liquido
criopreservacion
permite conservar los cultivos mqnteniendo su viabilidad y funcionalidad. tral la descongelacion las celulas mantienen el 90% de su capacidad de proliferacion y se reduce el riesgo de contaminacion. un uso excesivo de esta tecnica pouede ser letal para las celulas.
donde deben conservarse la celulas en crioconservacion
en viales especiales que aguanten las bajas temperaturas y puedan almacenarse.
crioprotector
protege las celulas en la congelacion evitando la formacion decristales, DMSO y glicerol
DMSO
un crioprotector toxico para las celulas que no debe permanecer mucho tiempk en contacto con ellas.
densidad celular
numero de celulas de un cultivo, cel/ml
4 x ncelx 10000
tecnicas para determinar la densidad celular
fases:
1. dilucion de la suspension celular.
2. toma de volumen de la suspension celular.
3. calculo de celulas en el volumen determinado.
4. calculo matematico para determinar la densidad cel/ml.
metodos para determinar la densidad celular
manuales: realizacion de una dilucion de la suspension celular y su posterior recuento de celulas mediante un hemocitometro o camara de contaje celular, camara de Neuvauer.
auromatico: ha mejorado la prcision, exactitud y rapidez. detectan el paso de la celula aprovechando la interferencia que produce el paso de la corriente elctrica o de la luz.
viabilidad celular
la proporcion de celulas vivas y funcionales existentes en el cultivo.
(n total de cel vivas/ cel vivas y muertas) x100
tecnicas para determinar la viabilidad celular
hay numerosos metodos pero el mas utilizado en el lab se basa en la evaluacion de la membrana. elular mediante colorantes.
la integridad de la membrana de las celulas que se encuentran en muerte celular se eltera y provoca aue el colorante entrde dentro de la membrana no intactavy la tiña. metodo de exclusion mediante azul de tripan. este es un colorante vital que tiñe azules a las celulas con lesion en su membrana, pero las que tienen la membrana intacta quedaran blancas o conun halo azul.
es una tecnica rapida sencilla ybarata pero tan solo determina las celulas muertas por la que tienen la membrana fragmentada por lo que no garantiza una tasa de supervivencia concreta.
como abrir un criovial
empapar un papel en alcoho 70% y abrir la tapa de la ampolla 1/4 parte para dejar salir la presion y el cambio de temperatura.