T.3. Citogenética y análisis cromosómico.
Cromosoma.
El material genetico organizado que se compone de una molecula de ADN de dobble helice en interaccion con proteinas (histonas y no histonas).
Estructuras dinamicas.
El cromosoma tiene estructuras dinamicas, porque cambian el nivel de condensacion a lo largo del ciclo celular (relajado o compactado).
- Doble helice de ADN--> Collar de perlas--> Solenoide--> Asas cromaticas--> Cromosoma.
Estudio genetico
Se lleva a cabo en el nivel de maxima condensacion (la etapa de metafase). CROMOSOMA METAFASICO.
Estructura del cromosoma metafasico
Cromatidas, telomero, constriccion secundaria, centromero, satelite.
Cromatidas
Dos filamentos lineales, exactamente iguales y paralelos.
Telomero
Porcion terminal de los cromosomas. Impide que los extremos cromosomicos se fusionen y asi mantiene la estabilidad de la estructura cromosomica necesaria para la replicacion.
Constriccion secundaria
Estrechamiento de las cromatidas, menos profundo que el centromero.
Centromero
Estrechamiento que divide los dos brazos. Se llama constriccion primaria o centromerica. Presenta una posicion constante en el cromosoma y suele estar asociado a secuencias de ADN altamente repetitivas.
Satelite
Segmento distal de un cromosoma que esta separado por una constriccion secundaria, tallo o pedunculo. Solo estan presentes en los cromosomas acrocentricos.
Brazos del cromosoma
Brazo p= brazo corto.
Brazo q= brazo largo.
La posicion del centromero
Permite clasificar los cromosomas morfologicamente.
Indice centromerico IC, ordena y clasifica los cromosomas.
IC= [long p/ (p+q)]x100
Tipos de cromosomas
-Metacentricos: centromero en el medio--> IC proximo a 50.
-Submetacentrico: centromero desplazado hacia uno de los extremos (da lugar a un brazo p y q)--> entre 25-45.
-Acrocentrico: centromero en una posicion muy distal brazo p muy corto y brazo q muy largo--> menor de 25.
-Telocentrico: centromero en un extremo solo hay un brazo q--> 0.
Celulas diploides
-Celulas que contienen 2n cromosomas.
-Cada unos de los cromosomas de cada pareja se denominan cromosomas homologos. (1 cromosoma de la madre y 1 del padre).
-Humanos--> genoma nuclear= 23 pares de cromosomas (22 autosomas y 1 par de gonosomas, cromosomas sexuales).
Celulas haploides
-Celulas que poseen n cromosomas.
-Los gametos (ovulos y espermatozoides) son haploides.
-Proceso de division--> meiosis.
-Los gametos masculinos pueden tener cromososma X o Y, pelo los femeninos siempre tendran X.
En que estado deben estar las celulas para realizar el estudios de sus cromosomas?
En division celular o mitotis (metafase).
Con que celulas se realiza el estudio de los cromosomas
Con las celulas blancas de la sangre. Porque son celulas nucleadas con capacidad para dividirse cuando se les agrega un agente mitogeno.
Obtencion de la muestra
La muestra de sangre periferica suele obtenerse por venopuncion en un tubo esteril con heparina sodica. Deben procesarse lo antes posible. No deben congelarse ni mantener altas temperaturas (provoca muerte celulas).
- Se utiliza heparina sodica como anticoagulante para evitar la formacion de coagulo que atrapa las celulas sanguineas.
- No debe utilizarse como anticoagulante EDTA porque tiene efecto toxico para las celulas.
-Las muestras de sangre coaguladas u obtenidas con el anticoagulante inadecuado ocasionaran fallo en el coultivo celular.
Siembra
Es la inoculacion de la muestra (sangre total o plasma con leucocitos) en un frasco Roux o tubo esteril con medio de cultivo, al cual se le adiciona fitohemaglutinina (FHA).
La siembra debe realizarse en condiciones esteriles, utilizando una tecnica aseptica adecuada y en cabina de flujo laminar para evitar contaminaciones.
El medio de lultivo en la siembra
El medio de cultivo que se utiliza con mas frecuencia para el cultivo de leucocitos es RPMI 1640.
La fitohemaglutinina
Es una proteina de origen vegetal con alta capacidad mitogenica. Se une a las mebranas de las celulas T y estimula la division celular y la actividad metabolica.
Cultivo celular
El cultivo de sangre periferica para la realizacion de extensiones cromosomicas debe realizarse a 37ºC y 5% de CO2 durante 72 horas. Transcurridas estas se ha alcanzado el mayor indice miotico y empieza a agotarse el medio de cutivo
Para paliar la falta de accesibilidad a los nutrientes de las celulas de la fase interior (por la sedimentacion) se conseja agitar los tubos a las 24 horas y a las 48 horas del inicio del cultivo.
Sacrificio del cultivo
El proceso de parada del cultivo en la etapa de metafase.
Trranscurridas las 72 horas de cultivo se añadeun analogo sintetico del farmaco colchicina, el Colcemid, que inhibe la polimerizacion de microtubulos, por lo que destruye el huso mitotico y se detienen las celulas en la metafase.
Solucion stock de Colcemid --> 10ug/ml, se deben añadir 0,2 ml por cada 10ml de medio de cultivo. Incubar durante 45-60 min a 37ºC.
Choque hipotonico
Celulas paradas en la metafase--> se someten a un tratamiento con una dilucion hipotonica que permitira que las celulas se hinchen y los cromosomas se separen entre si.
Como el tratamiento con solucion hipotonica hincha las celulas, el tratamiento posterior debe ser suave, sin movimiento bruscos que den lugar a metafases inclompletas.
Tiempo de choque hipotonico--> 20-40 min y condiciona la forma de liberacion de los cromosomas de la celula.
Tiempo excesivo= cromosomas se extienden demasiado y se pierde la estructura de la metafase.
Tiempo escaso= metafases cerradas y condensadas que no puenen liberarse del cromosoma y no se pueden estudiar.
Fijacion
Celulas detenidas en la metafase, hinchadas (por el choque hipotonico), se procede al lavado con solucion de Carnoy para la fijacion cromosomica.
El fijador hace que los acidos nucleicos precipiten y que los cromosomas se fijen, lo que favorece a la eliminacion de restos celulares.
El exceso de exposicion al fijador hace que las membranas de las celulas se rompan de forma prematura y que se pierdan los cromosomas.
Obtencion de la extension
Las celulas se extienden sobre porta objetos, esto favoreece a que los nucleos se alisen y que los cromosomas se peguen a la superficie.
La tecnica q se emplea es la tecnica de goteo, se dejan caer una o dos gotas de la suspension celular sobre un portaobjetos limpio desde unos 30 cm de alto. Fase fundamental para obtener buenas metafases y depende de la experiencia y practica del tecnico.
El envejecimiento de la preparacion se consigue con calor.
Una vez secos los portaobjetos se inicia la tenica de tincion.
En la extension cromosomica obtenida es importante analizar la densidad celular y el grado de distribucion de los cromosomas para determinar la calidad de la extension.
Tecnicas de tinción y bandeo cromosómico
Permiten la obtención de una serie de marcas (bandas) a lo largo del cromosoma que permiten la identificación de todo el cromosoma o segmentos específicos de este.
Tinción convencional
Una vez secas las extensiones cromos´ómicas se pueden teñir con tinción convencional.
Introducir el portaobjetos en una disolución de Giemsa al 2-3% durante 10 min, lavar con agua destilada y dejar secar.
Esto permite contar y agrupar los cromosomas por caracter´isticas morfológicas comunes.
Banda cromosómica
Es una parte del cromosoma que tiene apariencia más oscura o clara que sus segmento adyacente. Las bandas están localizadas en regiones delimitadas por marcas.
Región cromosómica
Es un área del cromosoma comprendida entre dos marcas y puede contener varias bandas.
Marca cromosómica
Es una característica importante en la identificación de un cromosoma y delimita las regiones cromosómicas. Son marcas, puntos de referencia o landmarks, los extremos de los brazos, los centrómeros y ciertas bandas.
Bandas y subbandas
Permiten:
- Identificar los cromosomas al obtener un patrón específico.
- Dividir el cromosoma por regiones.
- Evaluar el cromosoma y determinar alteraciones cromosómicas.
- Localizar genes específicos en las diferentes bandas del cromosoma.
Bandas de todo el cromosoma
- Bandas:
--> G.
--> Q.
--> R.
Bandas que tiñen determinados puntos del cromosoma
- Bandas:
--> C.
--> NOR.
--> T.
Bandas G (Giemsa)
Es la técnica de bandeo más utilizada en los laboratorios de obtención del cariotipo. Consiste en un digestión con una enzima proteolítica (tripsina) y su posterior tinción con Giemsa.
La tripsina degrada las proteínas y producee bandas claras y bandas oscuras en función del nivel de digestión, en las zonas de mayor condensación de los cromosomas la degradación de las proteínas será peor (bandas oscuras). Las zonas menos condensadas del cromosoma --> más claras.
Patrón específico:
-Bandas oscuras (G+ o G)--> regiones de ADN ricas en AT.
-Bandas claras (G- o R)--> regiones de ADN ricas en GC.
Bandas Q (quinacrina)
1º Técnica de bandeo descrita pot T. Carpensson.
Utiliza la tinción con mostaza de quinacrina o acridina y las preparaciones deben observarse bajo un microoscopio de fluorescencia.
Se observan bandas brillantes de distintas intensidades donde las más brillantes corresponden con las G+ (ricas en AT).
Es un método rápido pero poco duradero. en 1 min se pierde el brillo.
Bandas R (reverse)
El patrón de bandas que se obtiene es el negativo o reverso de las bandas G .
-Bandas claras en R (GC)--> bandas oscuras en G (G+)
-Bandas oscuras en R (AT)--> bandas claras en G (-G).
Bandas C
Esta técnica permite la tinción de las regiones de los cromosomas ricas en heterocromatina.
Se tiñe la región centromérica de cada cromosoma.
Los cromosomas se tratan secuencialmente con un ácido (ácido clorhídrico HCl), un álcali (hidróxido de bario BaOH2) y calor (60-65ºC). Por último se tiñen de Giemsa o fluorocromos y se visualizan en un microscopio de campo claro o de fluorescencia.
Bandas NOR
Las regiones NOR (Nucleolar Organizer Region) hacen referencia a los satélites. Contienen los genes ribosómicos que codifican para el ADN ribosómico.
Las bandas NOR aparecen en las regiones subterminales del brazo corto de los cromosomas acrocéntricos cuando los cromosomas se tiñen por nitrato de plata y se visualizan en un microscopio de campo claro.
Bandas T
Permite la tinción de los telómeros. Es una varienate del bandeo R que se obtiene tratando la precipitaciones con calor y tiñendolas con Giemsa.
Al prolongar los tiempos de incubación de las extensiones cromosómicas en las soluciones tampón, los cromosomas se visualizan más debilmente teñidos, excepto en sus regiones terminales, que aparecen con bandas muyy teñidas.
Ideograma
Representación esquemática de los cromosomas humanos con un patrón de bandas G.
Locus cromosómico
Término utilizado para definir el lugar que ocupa un determinado gen o marcador genético (secuencia característica de ADN) en un cromosoma.
ISCN
Sistema internacional de nomenclatura de citogenética humana. Establece una serie de normas estandarizadas que permiten identificar el locus cromosómico y definir alteraciones cromosómicas estructurales.
Los criterios que sigue son:
-Cromosoma 1º brazo corto 2º brazo largo.
-Las regiones de cada brazo se enumeran de centrómero a telómero.
-Las bandas de cada región se enumeran de centrómero a telómero.
- 7q31.1=
-->7 número de cromosoma.
-->q símbolo del brazo.
-->3 número de la región.
-->1 número de la banda.
-->2 separado con un . número de la subbanda.
Cariotipo
El ordenamiento de los cromosomas de un individuo de cuerdo con sus características morfológicas y estructurales. Es el resultado final de los análisis cromosómicos y permite la detección de alteraciones cromosómicas.
Orden en el cariotipo
-Tamaño:de mayor a menor.
-Posición del centrómero: se situan secuencialmente metacéntrico, submetacéntricos y acrocéntricos.
-Presencia o no de constricciones secundarias.
Indicaciones para el estudio de un cariotipo
-Periodo neonatal:
--> Ante la presencia de síndromes dismórficos, malformaciones o déficits neurológicos de etiología descoocida.
-P. infancia y adolescencia:
--> Retraso psicomotor (síndrome de Klinefelter).
--> Dismorfismos con anomalías viscerales no detectadas durante la infancia.
--> Estatura baja inexplicable (síndrome de Turner).
--> Hipogonadismo ( síndrome de Klinefelter, síndrome de Turner).
-P. edad adulta:
--> Padres de hijos con alguna enfermedad cromosómica.
--> Esterilidad por causas ginecológicas o endocrinas (síndrome de Klinefelter, síndrome de Turner).
--> Gestantes con dos o más abaortos espontáneos (portadores de traslocación).
-P. embarazo:
--> Edad materna avanzada.
--> Anomalía serológica materna por el test de triple screening.
--> Anomalía fetal ecográfica.
--> Riesgo de un síndrome cromosómico inestable.
Automatización de análisis citogenético
La automatización es evidente teniendo en cuenta el aumeto de la demanda en la actualidad y las técnicas citogenéticas consumen mucho tiempo por muestra y mucho personal que procesa cultivos y analiza al microscopio.
La década de 1980 marcó el inicio de la automatización de estos laboratorios.