Détermination protéines
Vitesse de migration dépend
• charge → pI faible , déprotonation rapide, migration rapide vers +
→ écart entre pH et pI
• taille
• conformation
HbA
Hémoglobine adulte normale
6e position → Glu = charge négative (COO-)
HbS
Hémoglobine pathologique → ne fixe plus correctement O2
6e position → Val
→ chaîne bêta mutée → charge neutre
→ anémies et ischémies
SDS-PAGE
Dénaturation de la protéine
→ Migration uniquement selon leur poids moléculaire (masse en Da)
Agent dénaturant SDS
Détergent anionique brisant liaisons faibles ( non-covalentes) H, électrostatiquer ou forces hydrophobes
→ protéine forme allongée
Bilan SDS
Toutes protéines charge (-) similaires et conformation aussi, diffèrent par poids, masse moléculaire
→ permet de caractériser la structure quaternaire
bêta-mercaptoéthanol
Brise, réduit les ponts disulfures
→ conditions réductrices
Caractéristiques du gel SDS-PAGE
Gel en Polyacrylamide → Acrylamide + bisacrylamide
→ Gradient de concentration élevé pour protéines de petit poids moléculaire
Reconnaissance d'isoformes
Apparition sur le gel à 2 niveaux différents (isoforme 1 → extrémité C-ter plus grande que isoforme 2)
→ par un anticorps reconnaissance N-ter
Détermination de la séquence peptidique
• Composition = nombre et nature des aa
• Séquence = ordre d'enchainement des aa
Hydrolyse sévère
Incubation avec HCI à T élevée pendant 24H
→ Rupture des liaisons peptidiques
→ libération → aminoacides libres
Dosage qualitatif
Détermination composition PAS séquence primaire
Étapes de détermination N-ter
Utilisation de Chlorure de Dabsyl
• Marquage → Fixation sur N-ter
• Hydrolyse → dans un tampon HCI 6N
→ Isolation aa fixé au chlorure de Dabsyl
• Chromatographie → identification
Principe de dégradation d'Edman
Chaque cycle retire un aa depuis N-ter
Étapes de dégradation d'Edman
• Marquage : Fixation du phenyl isothiocyanate sur aa à N-ter à pH=9
• Hydrolyse : Retrait du premier aa → Chaîne polypeptidique raccourcie mais intacte
• Chromatographie : Répétition jusqu'à identification totale de la séquence primaire
Aminopeptidase
Clivage du côté carboxyle à N-ter (côté droit)
Carboxypeptidase A
Clivage du côté amine du résidu à C-ter (côté gauche SAUF Lys, Arg, Pro)
Trypsine
Clivage du côté carboxyle des résidus Lys et Arg (côté droit)
Chymotrypsine
Clivage du côté carboxyle de Tyr, Trp, Phe, Leu et Met (côté droit)
Bromide de cyanogène
Clivage du côté carboxyle de Met (côté droit)