Introduction à l'enzymologie industrielle
Caractéristiques d'une enzyme
- protéines (sauf ribozymes)
- synthétisées par des êtres vivants
- catalyseurs biologiques
- intactes en fin de réaction
- agissent à faible C°
- spécifique d'une R°
- 10 000 à 1 000 000 Da
Structure primaire d'une prot
enchainement d'AA
Structure secondaire d'une prot
repliement de la prot pour former des hélices alpha et feuillets beta
structure tertiaire de la prot
assemblage des structures secondaires (pdi)
structure quaternaire d'une prot
sous unités / blocs indépendants (uniquement pour certaines prot)
Importance de la structure 3D d'une protéine
essentiel pour son activité et sa fonction
spécifité d'une enzyme
spécifique d'une R° chimique sur un substrat donné
caractéristiques du site actif d'une enz
- composé d'un petit nombre d'AA
- forme une crevasse ou une poche dans la prot
- affinité élevée pour le substrat
def cofacteur
corps chimique intervenant obligatoirement dans la R° enzymatique
rôles du cofacteur
- transporter ou compléter un substrat
- accepter un produit
- participant à la structure de l'enzyme
Types de cofacteur
- ions organiques
- molécules organiques = coenzymes :
○ libres : se dissocie de l'enz à chaque réaction catalysée
○ groupement prosthétique : lié à la prot
Catalyse enzymatique =
Accélaration de la R° : le catalyseur baisse l'energie d'activation de la R°
modèle de Michaelis Menten
E + S <> ES > E + P
Vitesse iniatiale de la R° (apparition) :
- vitesse d'apparition du produit au cours du temps
- pente de la tangente à l'origine de la courbe d'apparition de P en fonction du temps à [E] donnée
vitesse initiale de la R° (disparition) :
- vitesse de disparition du substrat au cours du temps
- pente de la tangente à l'origine de la courbe de dispariton de S en fonction du temps à [E] donnée
Vmax
la vitess de la réaction n'augmente plus à partir d'une certaine concentration S0
Cinétique d'ordre 1
linéaire : Vi proportionnelle à [S]
Cinétique d'ordre 0
asymptotique : Vi indépendante de [S]
grandeurs reliées dans le modèle de Michaelis Menten
- vitesse initiale de la réaction
- concentration initiale en substrat
- paramètres caractéristiques de l'enz
km : def et caractéristiques
= cste de michaelis menten
= valeur de [S0] pour laquelle Vi est à la moitié de Vmax
- unité : mol/L
- depend du substrat et des condition exp ( T, pH)
approximation du modèle de Michaelis Menten
- concentration en enz très faible
- hypothèse de l'etat quasi stationnaire
rapport entre km et l'affinité du substrat pour l'enz
+ km est faible + l'affinité du S pour E est importante
Equation de Michaelis Menten
Vi = (Vmax + [S]) / (km + [S])
représentation en double inversr
- ordonnée à l'origine = 1/Vmax
- qd y= 0 on a x = - 1/km
vitess de reaction
= quantitié d'enzyme qui provoque la transformation d'1 umol de S en 1 min ( 1 UI = 1umol/min)
-> à une T et pH spécifié + concentration saturante de S
activité spécifique
= nb de umoled de substrat transformé par minute et par mg
-> UI/mg
facteur de purification FP
FP = AS (n+1) / AS (n0)
activité totale AT
= nombre de umol de substrat transformé par minute
-> UI
rendement de purification
Rdt (%) = AT(n+1) / AT (n0)
activité moléculaire spécifique (AMS) ou constante catalytique kcat
= nb de moles de substrat transformé par unité de temps et par mole d'enz
-> min-1 ou s-1
AMS ou kcat (équation)
= Vmax / [E]
techniques physico- chimiques pour suivre la réaction enz
- colorimétrie
- fluorométrie
- spectrophotométrie
- electrode pH : augmentation de l'acide ou pO2 et CO2
technique par la spectrophotométrie
-suivre l'apparition de P ou disparitionbde S
- suivi de l'évolutionbde l'absorbance avec la loi de Beer Lambert A = Epsilon × l × c
formule pour le suivi spectrophotométrique
(delta Abs / delta t) × (1 / epsilon × l) × ( VT / Ve)
- > UI/L
effet de la température sur la vitess de réaction
- activation des molécules
- inactivation
effet du pH sur l'activité enzymatique
- pH optimal
- influe l'etat d'ionisation de E et S
- à chq extrême : E dégradé de manière irréversible
inhibiteur compétitif
- se lienau site de fixation du S et empêche celui-ci de se pier à l'enz ( ne peut être lié en même temps que le substrat)
- Vmax =
- km augmente
inhibiteur non-compétitif
- se lie à un site de fixation secondaire et change la conformation de E : le substrat ne peut se lier ( se lie à E indépendamment de S)
- Vmax diminue
- km =
signification des 4 chiffres de la classification EC : EC X1. X2. X3. X4
X1 : type de reaction catalysée
X2 : sous classe : mécanisme de la réaction
X3 : sous sous classe : mide d'action, type de catalyse
X4 : enz au seinbde la sous sous classe
-> n° unique
X1 = 1
= oxydoréductases
-substrat oxydé : accepteur d'electrons ou de H
- substrat réduit : donneur d'electrons ou de H
X1 = 2
= Transférase
- transfert d'un groupement d'une molécule donneuse ( = cofacteur) vers une molécule réceptrice
X1 = 3
= Hydrolase
- hydrolyse de liaisons avec H2O
X1 = 4
= Lyase
- clive des liaisons simples sans H2O
- formation de doubles liaisons
X1 = 5
= isomérase
réaction d'isomérisation de groupe, de position ou de fonction au sein d'une même molécule
X1 = 6
= ligase
catalyse l'assemblage de 2 molécules ou de deux parties d'une même molécule grâce à l'energie libérées lors de l'hydrolyse de l'ATP
caractéristiques classification CAZy
- étude de la sequence des AA de la prot : caractéristique structurale des enz
- pour enz actives dur des hydrates de carbone (glucides)
- regroupement en clans
classe 1 (CAZy)
= glucoside hydrolase
- hydrolise de liaisons osidiques
classe 2 (CAZy)
= glycosyl transférase
- transfert spécifique d'un ose d'un intermédiaire activé sur une autre molécule
classe 3 ( CAZy)
= polysaccharide lyases
- rupture des liaisons osidiques par beta-élimination
- formation de doubles liaisons
classe 4 (CAZy)
= carbohydrate estérase
- estérase catalysant la O ou la N- désacétylationbdes glucides (ester = acide + alcool)
- le sucre joue le rôle de l'acide iu de l'alcool
classe 5 (CAZy)
= carbohydrates binding module
- élément de structure de l'enz capable de se lier spécifiquement à un glucide sans activité catalytique propre
sources d'enzymes utilisées industriellement
- + de 50% : champignons ou levures
- 1/3 : bactéries (organismes extrémophiles)
- 8% : animaux
- 4% : végétaux
domaines impliqués dans le dev d'enz commerciales
- recherche de nouvelles enz
- fermentation
- purification
- remodelage d'enz
enz d'origines végétales ayant une activité protéolytique
- papaïne
- broméline
- ficine
autres enz d'orgine végétale
- amylase
- lipoxygénase de soja
enz d'origine animale
- présure (chymotrypsine + pepsine)
- trypsine
- pepsine
- lipases
inconvénients des enz d'origine non fermentaire
- dépendante de l'appro en MP
ex : penurie de veau, irrégularité des récoltes
- procédés d'extraction ( difficile, rdt)
- présence dans les tissus animaux ou végetaux : molécules problématiques
caractéristiques des enz d'origine microbienne
- majorite
- faible coût de production
- teneur en enz mieux contrôlable
- compo des extraits connue et constante
caractéristiques préparations commerciales d'enz d'origine microbienne
- micro-organismes producteurs : souche classique ou obtenuet par recombinaison génétique
- micro-organisme généralement absent
- une ou plusieurs activités enzymatiques
-standardisées et stabilisées par des diluants / conservateurs
- respect de la réglementation
avantages des enz d'origine microbienne
- production independante des contraintes saisonnières et géographiques
- MP bon marché
- amelioration des souches optimisation des conditions de fermentation
inconvénients des enz d'origine microbienne
- investissements lourds
- risques de contamination
etapes pour faire des enz d'origine microbienne
1) criblage
2) augmentation de la productivité
3) condition de prod : fermentation
4) extraction / purification
5) formulationb/ conditionnement
def enz alimentaire
- obtenues à partir des olantes, d'animaux, ou de micro-organismes y compris par fermentation qui contient une ou plusieurs enz capables de catalyser une reaction biochimisue spécifique
- peuvent être ajoutées à des denrées alimentaires a des fins technologiques à toutes étapes : fabrication, transformation, preparation, traitement, conditionnement, transport ou entreposage
Caractéristiques auxiliaires technologiques
- non consommée comme ingredient
- volontairement utilisée
- repond à un objectif technologique
- présence non intentionnelle mais techniquement inévitable (pas de risque sanitaire, pas d'effet technologique sur le produit)
statut enzyme active
additif alimentaire
statut enzyme inactive
auxiliaire technologique
caractéristiques additifs alimentaires
- ajoutés intentionnellement
- exerce une certaine fonction technologique spécifique (coloration, conservation...)
- statut d'IG alim
- dans liste IG
réglementation pour les additifs alimentaires
- principe de liste positive
- harmonisée au niveau européen
- figure dans liste IG
- réglement UE n° 1333/2008
- reglement UE n°231/2012
enz qui sont des additifs alimentaires:
- lysozyme
- invertase
réglementation sur les auxiliaires technologiques
décret n°2011-509 du 10/05/2011
- conditions d'autorisation et d'utilisation : autorisation préalable, déclaration
liste des enz autorisées comme aux. technologiques
annexe I-C de l'arrêté du 19 octobre 2006
règlement (CE) n°1332/2008
constitution de dossiers auprès de la comissions européenne piur inscription sir la liste des enz autorisées
AMFEP =
= Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products
- aspects scientifiques, techniques, juridiques et/ou réglementaires
- expertise
- informer sur législation, efficacité, sécurité, aspects environnementaux
- relations avec institutions
- application en alimentation humaine (food enzymes), animal (feed enzymes) et autres applications (technical enzymes)