BIOLOGIA 21
Cos'è lo splicing?
Lo splicing è il processo grazie al quale vengono rimossi gli introni dal mRNA trascritto, grazie all'azione di molecole ribonucleoproteiche dette snRNP.
Gli introni sono conservati fra le specie?
Sì
Come varia la lunghezza degli esoni all'interno di specie diverse? E il numero di essi per gene?
All'interno di specie diverse come Drosophila e l'uomo si vede come la lunghezza degli esoni si attesta tra i 100 e i 200 nucleotidi, essendo quindi conservata. Questo dipende dal fatto che i nucleosomi hanno proprio questa lunghezza (147 nucleotidi+50 DNA linker), quindi sembra che gli esoni si organizzino proprio attorno ad essi.
Il numero di esoni per gene invece cambia fra specie e specie, in particolare all'aumentare di esso aumenta anche la complessità dell'organismo.
Come varia la lunghezza degli introni fra specie e specie? E il numero?
La lunghezza degli introni è molto eterogenea tra specie diverse, come ad esempio accade per Drosophila che possiede introni prevalentemente fra le 100 e le 200 basi, mentre negli uomini si attesta tra le 200 e le 500 con picchi di 30000 basi per introne.
All'aumentare del numero di introni aumenta la complessità dell'organismo.
Quanti tipi di splicesoma conosciamo?
Uno comune a tutti gli mRNa
Struttura splicesoma
Lo splicesoma è costiutito da particolari Rna chiamati snRNA, che vengono legati a molecole proteiche a costituire snRNP. E' lungo all'incirca 200 nucleotidi. Assumono una strutturfa a forcina nel 3' e strutture secondarie molto complesse.
Quanti tipi di snRNP conosciamo?
Esistono 5 tipi di snRNP:
- snRNP U1
- "" U2
- "" U4
- "" U5
- "" U6
Da che RNA polimerasi vengono sintetizzati gli snRNA?
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Che caratteristiche sfruttano le snRNP per funzionare?
La caratteristica principale che viene utilizzata dalle snRNP è la complementarità di basi con il filamento di RNA, quindi individuano la posizione su cui lavorare proprio grazie ad essa. Inoltre anche tra le stesse varianti di snRNP troviamo complementarità di basi per legarsi fra di loro, per riuscire a legarsi, formare il complesso dello splicesoma e funzionare.
Qual è la struttura comune a tutte le snRNP?
La struttura comune a tutte le snRNP è un complesso proteico a forma di anello formato da 7 molecole proteiche chiamato SM, le proteine disposte ai lati sono variabili.
Come avviene la biogenesi delle snRNP?
Gli snRNA vengono trascritti grazie all'azione della RNA pol III, in geni contenuti nel nucleo. Vengono trasportati al di fuori del nucleo grazie ad un'esportina chiamata CRM1. Nel citoplasma vengono assemblate le snRNP, che vengono poi trasportate all'interno grazie all'azione di un'importina. La biogenesi è quindi citoplasmatica.
Come vengono riconosciute le sequenze da splicesare? Quali sono le 4 sequenze fondamentali?
Le sequenze da splicesare vengono riconoscite dato che sono sono sequenze consenso dello splicing, ovvero conservate e riconosciute. Le 4 sequenze fondamentali sono:
- sito donatore di splicing, sequenza GU e si trova all'estremità 5'dell'introne. E' preceduto da una sequenza AG.
- sito accettore di splicing, sequenza AG, e si trova tra un introne e l'inzio di un esone, viene solitamente seguita da un guanina o da una adenina.
- sequenza polipirimidinica, che permette il riconoscimento della posizione di AG. E' costituita appunto da molte basi pirimidiniche (citosina e uracile).
- Adenina di ramificazione o branching point. Un'adenina che serve come punto reattivo per formare la struttura a cappio che serve per l'uscita dell'introne.
Che tappe troviamo nel meccanismo di splicing?
Innanzitutto U2 e U6 presentano parziale complementarietà delle basi, che permette di ad essi di avvicinarsi, ripiegando l'introne e portando vicini gli esoni così da facilitarne l'unione.
Il meccanismo presenta seguente tappe:
1- snRNP U1 e sn RNP U2 si legano in particolare al sito donatore di splicing in 5' e al sito di adenina di branching.
2- snRNP U4/snRNP U6, che sono associate grazie alla complementarietà delle basi agiscono insieme. In particolare U6 è un ribozima, mentre U4 è il suo inibitore. Una volta entranti in contatto con la molecola di mRNA u4 si stacca dal complesso e permette a U6 di agire.
3- snRNP U5 si lega al complesso fromato da U1, U2 e U6 per promuovere il legame tra gli esoni avvicinandoli fra di loro.
Che legame troviamo fra l'adenina nel punto di branching e snRNP U2? Come si forma il legame che permette l'uscita a cappio dell'introne?
Il legame avviene fra le basi circostanti all'adenina e snRNP U2, grazie alla complementarietà delle basi. L'unica base che rimane fuori è appunto l'adenina di branching che viene posta esternamente e resa estremamente attiva.
Il legame che si forma fra l'adenina di branching e la snRNP U2 è un legame di tipo 2'-5', molto anomalo tra nucleotidi. Questo avviene così da lasciar libero il gruppo ossidrile in C3 dell'ultimo nucleotide dell'esone, per formare il legame 3'-5' con il primo nucleotide dell'esone successivo. Il legma si forma quindi fra guanina del sito donatore di splicing e gruppo fosfato dell'adenina di branching, si forma in seguito un legame fosfoesterico fra 3' dell'ultimo nucletoide dell' esone e 5' del nucleotide dell'esone successivo.
Dove si aggancia il complesso di splicing per svolgere la sua funzione?
Il complesso di splicing si lega direttamente alla coda del C-terminale dell' RNA polimerasi e inizia a svolgere il suo compito mentre essa sta trascrivendo.
In che ordine vengono rimossi gli introni?
Gli introni non vengono necessariamente rimossi nell'ordine in cui si trovano, ma anzi alcuni vengono eliminati prima di altri.
Con cosa vengono marcati i punti di unione esone-esone?
I punti di unione esone-esone vengono marcati con una molecola proteica, che funge come strumento di controllo della maturazione del DNA.
Cos'è lo splicing alternativo?
Lo splicing alternativo è il processo per cui si può ottenere un trascritti maturi diversi, e quindi proteine leggermente diverse, partendo dallo stesso trascritto primario, regolando l'attività di splicing, ottenendo quindi isoforme (le proteine leggermente diverse) grazie alla traduzione. Ovvero vengono eliminati esoni/ mantenuti introni per "manetere" o "silenziare" detrminati domini della proteina.
Da cosa viene regolato lo splicing alternativo?
Da stimoli extracellulari e quindi dalle necessità stesse della cellula.
gene CALCA
6 esoni e vari introni. In base a come viene maturato si ottengono diverse isoforme della proteina:
- se viene eliminato l'esone F si ottiene calcitonina
- se viene eliminato esone E si ottiene CGRP, fondamentale per la percezione del gusto.
Queste due proteine sono diverse in base al tessuto in cui si trovano.
gene per la FIBRONECTINA
Abbiamo due esoni particolari (EIIIB e EIIIA) che contengono le sequenze di legame ai recettori della membrana tipici delle proteine di membrana. Si possono ottenere due trascritti maturi:
- mantenendoli si ottiene la tipica forma della fibronectina
- negli epatociti, dove vengono eliminati, si ottiene un tipo di fibronectina che ha perso la capacità di interagire con la membrana
gene per l'ALFA TROPOMIOSINA
proteina largamente presente nel tessuto muscolare striato, si possono ottenere diverse isoforme grazie al fenomeno dello splicing alternativo prodotte da:
- tessuto muscolare liscio;
- sistema nervoso centrale;
- fibroblasti.
gene DSCAM
gene molto grande e descritto prevalentemente in Drosophila, 115 esoni raggruppati in 4 serie di esoni alternativi. Quando le cellule operano splicing su questo gene mantengono gli esoni non oggetto di splicing e 1 esone per serie, ottenendo più di 38 mila combinazione. Questa proteina è fondamentale per creare collegamenti fra neuroni, fungendo da etichetta per cinoscerne altri e creare dei circuiti neuronali. Due neuroni con la stessa isoforma di DSCAM non possono formare sinapsi, mentre due con diverse isoforme ci riescono.
Quali sono i principali metodi di splicing alternativo che conosciamo?
Sono: exon skipping, siti donatori alternativi, siti accettori alternativi, mantenimento introne e esoni alternativi.
Come viene regolato lo splicing alternativo?
Servono molecole che rincoscono reprimono (proteine hnRNP) o promuovono l'attività di splicing (proteine SR), che sono tessuto specifiche e agiscono per garantire la produzione di proteine più efficienti possibili alle necessità della cellula in cui si trovano. Essi riconoscono particolari sequenze dette SRE, che sono specifiche sequenze regolatorie all'interno del trascritto.