Biokemi del 4
Jonbyteskromatografi
- Separationsprincipen - provkomponenterna separeras baserat på deras laddning
- Stationär fas - består av laddade kulor (jonbytarmassa)
1. katjon: binder positivt laddade komponenter, jonbytarmassan är negativt laddad
2. Anjonbytare: binder negativt laddade komponenter, jonbrytarmassan är positivt laddad
- Bindning - Provkomponterna med motsatt laddning till jonbrytarmassan binder till denna, hur starkt den binder beror på nettoladdningen, högra laddning starkare adsorption
- Eluering - för att eluera ut målproteinet måste man förändra miljön, det kan göras genom redducera nettoladdningen genom att ändra pH, addera en konkurrande jon som "blockar" laddningen på jonbrytningen
Gradienteluering - under euleringen startas en gradient och de absorberade provkomponenterna elueras ut i ordning beroende av sepektive komponents nettoladdning, ju fler laddade grupper proteinet har, desto senare släpper proteinet från kolonnen
Val av jonbrytare
- Proteinets laddning vid pH 7 - högre isoelektriskt punkt än pH 7 kommer den vara negativt laddat vid pH 7, lägre isoeletrisk punkt än pH så är den positivt laddad vid pH 7
- Vilken jonbrytare - hög isoelektrisk punkt anjonbytrare flr den binder negativa laddningar vid låg isoelektrisk punkt kajonbytare för den binder positiva laddningar
Gelfiltreringskromatografi
- Princip - separerar molekyler baserat på deras storlek
- Stationär fas - Porösa kulor med en viss porstorlek
- Funktion - större molekyler som inte kan komma in i kulorna elueras först medan mindre molekyler som kan komma in i porerna elueras senare
Användning - Avsaltning, separation av proteiner och molekylviksbestämning
Affinitetskromatograft
- Princip - separerar molekyler baserat på deras förmåga till specifik bindning
- Stationär fas - innehåller en ligand, ett substrat eller en antikropp som är specifik för det protein man vill rena
- Funktion - molekyler som har affinitet för liganden binds till den stationära fasen, de budna molekylerna kan elueras genom att ändra pH eller jonstyrka, eller genom att tillsätta liganden i överskott
Användning - Mycket effektiv rening av specifika proteiner
HPLC
- Princip - Högupplösande separationer genom användning ac högt tryck för att driva den mobila fasen genom en kolonn packad med små partiklar
- Stationär fas och mobil fas - Valda baserat på de egenskaper man vill separera, såsom storlek, laddning, hydrofobicitet eller specifik bindning
- Funktion - Ger hög upplösning, snabbhet och känslighet
Användning - kan användas för olika typer av separationer beroende på val av stationär och mobil fas
Kloningsvektor och antibiotikaresistens
- Funktion - Överföra DNA-sekvenser till en värdcell, se till att de överförda DNA:t är stabilt och kan replikeras, inte brytas ner i värdcellen.
- Kan vara - Plasmider, virus, värdcellen är oftast en bakteriecell
- Varför vektorer med antibiotikaresistans - Hitta de bakterier som tagit upp vektorn, bakterier med vektor växer i närvaro av antibiotika