Méthodes d'extraction et purification des enzymes
Schéma générale de la purification d'une enzyme:
source > extraction > purification
élements à prendre en compte dans la purification d'une enzyme
- dosage de la quantité produite
- contrôle de la pureté
- contrôle de l'activité
- stockage
objectif de l'extraction
libérer les enzymes des cellules ou structures subcellulaires
élements de la cellule à détruire lors de la destruction
- paroi
- membrane plasmique
- structures subcellulaires
comment extraire des enz?
- moyens physiques ou chimiques efficaces
- non denaturants
- extraction a froid en présence de substances protégeant l'act enzymatique
lyse cellulaire :
en mettant les cellules dans une solution hypotonique on crée un choc osmotique qui, en permettant à l'eau d'entrer dans la cellule, la fait gonfler jusqu'à ce que les membranes se rompent et libèrent leur contenu dans le mileu
congélation-décongelation
des cycles de décongélation (azote liquide) et de décongélations répétés brisent les membranes cellulaires
digestion enzymatique
l'action conjuguée et simultanée de cellulases et de pectinases désagrègent les parois pecto-cellulosiques et libèrent des cellules dénudées (protoplastes) qu'on peut faire éclater, par la suite, par simple choc osmotique
déchiquetage mécanique :
les appareils utilisés coupent et cisaillent les tissus avec des lames rotatives tournant à grande vitesse. Cette technique est particulièrement utilisée pour des tissus trop fibreux, difficiles à homogénéiser autrement (feuilles, tiges, graines...)
broyage
divers dispositifs sont utilisés pour broyer le matériel biologique : mortier, potter manuel ou motorisé
lyse mécanique
des agents abrasifs (poudre de diatomée, sable silicieux, particules de céramique...) sont agités fortement en présence des cellules ou tissus qu'on veut lyser
décompression explosive
des cellules pressurisées au gaz (azote) sont brutalement décompresséed pour briser les parois résistantes
traitement aux ultrasons
les ondes ultrasoniques causées par un generateur brisent les cellules et en libèrent le contenu
sédimentation ou centrifugation différentielle
= processusbde séparation au cours duquel les substances contenues dand une solutions de déposent
effet de la centrifugation sur la sédimentation
accélération
de quoi depend le coeff de sédilentation
- masse, inverse de la densité et forme de la particule
- densité du milieu
mode de précipitation des protéines (relargage ou précipitation fractionnée)
- par sels neutres
- par variation de pH
principe de précipitation des prots par sels neutres
la plupart des protéines sont piuns solubles à des concentrations élevées en sels
principe de précipitation des prots par variation de pH
comme pour les AA m, une prot présente un minimum de solubilité à un pH proche de son pHi
buts et principes de la dialyse
- séparation des protéines des autres molécules à travers une membrane semi-perméable
- permet d'éliminer les sels et autres petites molécules mais pas de distinction entre protéines
- molécules de grande taille : restent dans le sac
- molécules de petites tailles et ions : dans le dialysat
stabilisation lors de la purification
= NECESSAIRE
- pH : solution tampon > zone "physio"
- T : prot facilement dénaturées à hautes température
- protease : ajout d'inhibiteurs de proteases
propriétés pouvant être exploitées pour separer / purifier des protéines :
- taille moléculaire
- solubilité
- charge électrique
- affinité biologique
méthodes de purification par la taillle :
- dialyse
- filtration et ultrafiltration : filtre en profondeur, filtre écran
- chromato d'exclusion moléculaire
- centrifugation en gradiant de densité : zone de bande, isopycnique
dialyse
= technique qui permet de séparer des substances en utilisant leurs capacité respevtives à franchir les pores d'une membrane appelée membrane de dialyse
- éliminer les produits diffusibles
- équilibrer une solution protéique
- concentrer une solution protéique
filtres en profondeur
constitués de substances fibreuses (amiante, cellulose, coton...) ou de substances agglomérées (sable, charbon)
filtres écrans
retiennent à leur surface toutes les particules dont la taille est supérieure à celle des pores du filtre
ultrafiltration
séparation de substances selon leur taille moléculaire, donc selon leur poids moléculaire, les membranes jouent le rôle de filtres-écrans
etapes de la centrifugation en gradient de densité : zonalz, de bande
1) former un gradient de densité dans un tube de centrifugation : le gradient empêche un courant de convection
2) déposer un petit volume de solution contenant les protéines à l'extrémité supérieure
3) faire tourner le rotor : les protéines se déplacent dans le gradient et se déplacent en fonction de leur coefficient de sédimentation -> obtention de bandes séparées de protéines
4) récupération de chaque bande grâce à un trou percé dans le tube -> activité de chaque fraction peut être dosé dans ces gouttes
centrifugation en gradient de densité : isopycnique à l'équilibre
- séparation uniquement sur la base de leurs densités et non de leurs tailles
- après un certains temps : rassemblement des particules à un point où leur densité est égale à celle du milieu de sédimentation
chromatographie d'exclusion moléculaire
- séparation fonction de la taille selon que les prots pénètrent ou non dans les mailles du gel
- les molécules à haut PM sortent en 1er
- relation lineaire entre le log de la masse et le volume d'élution
se quoi est fonction la solubilité des protéines
- pH
- force ionique
- propriétés électriques du solvant
- température
précipitation isoélectrique (effet du pH)
- au pHi : solubilité minimale
- charge globale = nulle
- formation d'agrégat
précipation par des sels
- solubilité fonction de la concentration en sel ( = force ionique)
- force ionique faible : effet dissolvant (salting-in)
- force ionique élevée : effet insolubilisant (salting out)
fractionnement par des solvants
- ajout d'un solvant organique neutre miscible à l'eau diminue la solubilité dans l'eau de la plupart des prots globulaires -> précipitation
- plus la constante diélectrique de l'eau est elevé plus les protéines sont solubles dans l'eau
constante diélectrique :
pouvoir de solvatation de l'eau pour des ions dissous (comme les protéines)
principe de l'electrophorèse en zone
dépalcement de particules chargées dans un champs électrique continu
principe de l'electrophorèse en zone
dépalcement de particules chargées dans un champs électrique continu
de quoi depend le déplacement des particules chargées dans un champs électrique continu :
- temps de migration
- force ionique du tampon
- température
- courant electrique
- forced de freinage
- pH du tampon
types d'electrophorèses classiques
- électrophorèse sur acetate de cellulose : + rapide et spécifique des prots
- électrophorèse en gel : sépare les protéines à la fois selon leur mobilité electrophorétique et de la filtration sur gel (gels = polyacrylamide ou agarose)
elctrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) en conditions dénaturantes : SDS-PAGE
SDS : détergent qui confère au prot une forme de bâtonnet + apporte une charge négative globale à la prot
-> séparation en fonction de la masse moléculaire
chromatographie échangeuse d'ions
- formation de liaisons ioniques : le support est composé de molécules insolubles contenant des charges électriques de même signe
- utilise le comportement acido-basique des prots
- résines échangeurses de cations ou d'anions
- échangeurs cellulosiques
chromatographie sur cristaux d'hydroxyapatite
- hydroxyapatite = minéral cristallin composé de calcium et de phosphate
- affinité pour le calcium et éhangeuse de cations
chromatographie d'affinité
- repose sur les interactions spécifiques qui peuvent exister entre deux molécules
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